Ni琼脂糖凝胶说明书
Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins
目录号： K0010
保 存： 20%乙醇中 2-8℃保存
组分说明
Cat.No. K0010A K0010C
Volume 10ml 100ml
产品简介
该镍柱纯化系统对6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6 个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4 个 Ni2+ 螯合位点，较只有3 个螯合位点的Ni-IDA 结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的 His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。
支持物：CL-6B 琼脂糖凝胶
载量：20-30mgHis标签蛋白/ml 填料
粒径：50-160μm
注意事项
1. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT 和EDTA。
2. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
3. 为提高纯化效率，首先确定BindingBuffer 和 ElutionBuffer 中咪唑的*使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑（20-500mM）洗脱蛋白，并通过 SDS-PAGE 或 WesternBlotting 来检测目的蛋白的纯度。
4. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45µm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用 0.45µm 过滤器过滤。
5. 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。
操作步骤
组装层析柱
1. 将填料混匀后加入层析柱，室温静置10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：（1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mgHis标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
（2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。 （3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2. 向装填好的柱中加入5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用 10 倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。
I 可溶性蛋白的纯化（SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方详见附表1）
1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。
2. 将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。
3. 使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
4. 使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
5. 洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。
II 包涵体蛋白的纯化（InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方详见附表2）
1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml 细菌裂解液，超声裂解菌体。
2. 离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer中（如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5mM磷酸酶抑制剂混合物）。
3. 重复操作2，直至包涵体清洗干净（呈较洁净的乳白色状）。
4. 将沉淀重悬于Inclusion BodyBinding Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。
5. 10,000×g离心20分钟，将上清以孔径为0.45 μm的滤膜过滤。
6. 将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。
7. 使用15倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
8. 使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
9. 洗脱后，依次使用3倍柱体积的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。
注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低BindingBuffer 中的咪唑浓度（5mM 或更低）。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低 pH 缓冲液作为洗脱缓冲液（pH6.5，pH5.9 或 pH4.5）。 柱再生当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1. 使用2 倍柱体积的6M 盐酸胍冲洗后，使用3 倍柱体积的去离子水冲洗。
2. 使用 1 倍柱体积2% SDS 冲洗。
3. 依次使用 1 倍柱体积的25%、50%、75%和5 倍柱体积100%乙醇冲洗，再依次使用 1 倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。
4. 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。
5. 使用 5 倍柱体积含50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。
6. 使用 3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积20%乙醇冲洗。
7. 4°C 保存。
8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5 个柱体积的 50 mM NiSO4再生，3 个柱体积的Binding Buffer 平衡。
1: 蛋白分子量标准
（分子量由大到小分别为：90/66/45/27/ 14.4kDa）
2: 全菌裂解液
3: 流穿收集液
4: 洗脱收集液
1（洗脱缓冲液，含 500mM 咪唑，收集第1 个柱体积）
5: 洗脱收集液
2（洗脱缓冲液，含 500mM 咪唑，收集第 2 个柱体积）
6: 洗脱收集液
3（洗脱缓冲液，含500mM咪唑，收集第3 个柱体积）
7: 洗脱收集液
4（洗脱缓冲液，含500mM 咪唑，收集第 4 个柱体积）
附表
附表 1. 可溶性蛋白纯化缓冲液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl
SolubleBindingBuffer 20mM 10mM 0.5M
SolubleElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M
附表 2. 包涵体蛋白纯化缓冲液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl 尿素/盐酸胍
InclusionBodyBindingBuffer 20mM 5mM 0.5M 8M/6M
InclusionBodyElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M 8M/6M
