Protein A+G琼脂糖凝胶说明书

Protein A+G Agarose  

Cat. No.   K0349    

保存：2-8  ℃

组分说明

                                              Cat.No.         K0349

                                              Volume          2 ml

产品简介

  本产品为Protein A 和  Protein G 共价交联到4% Agarose beads 上的产物，并保存在含有0.05%叠氮钠的TBS 缓冲液中，2 ml Protein A+G Agarose 中共含有 0.5 ml Agarose beads，约2 mg 重组的Protein A+G。主要用于免疫沉(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。适用于免疫沉淀所有 Protein A Agarose 和Protein G Agarose 单独可以免疫沉淀的抗体，包括 Mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, Rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, Rabbit IgG, Rabbit and Goat polyclonal Abs，以及Human IgG1, IgG2,IgG3 和IgG4。本产品如果用于常规的免疫沉淀，可以免疫沉淀100 次。

注意事项

1. 请勿冷冻保存本产品。

2. Protein A+G Agarose 使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。

3. 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作步骤

1.  免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

1.1.  蛋白样品的准备：

1.1.1  对于10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入

        500μl至2 ml细胞裂解液裂解细胞。

1.1.2.  对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

1.1.3.  对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注：  详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

1.2.  去除非特异性结合(可选做)：

1.2.1.  取200  μl至1 ml蛋白样品，蛋白量约为200  μg至1 mg，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20  μl充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。

1.2.2. 2500 rpm(约1000 g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：  所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

1.3.  免疫沉淀：

1.3.1.  加入0.2-2  μg用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

1.3.2.  再加入20  μl充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。)

1.3.3. 2500 rpm(约1000 g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。

1.3.4.  用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1 ml。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。

1.3.5.  完成后一次洗涤后，去除上清，加入20-40  μl 1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

1.3.6. 100℃或沸水浴处理3-5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。

2.  免疫共沉淀：

   参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(CO-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

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