Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）说明书
6×His-Tagged Protein Purification Kit
目录号： K0894
保 存： 蛋白酶抑制剂混合物，-20℃； 其它组分，2-8℃。
组分说明
Cat.No. K0894 K0894A
KitSize 2ml 5ml
Ni-Agarose 填料 2ml 5ml
细菌裂解液 25ml 65ml
1MTris（pH7.9） 6ml 15ml
1M 咪唑 25ml 65ml
3M 氯化钠 50ml 2×60ml
蛋白酶抑制剂混合物 0.3ml 0.7ml
亲和柱空柱 1个(6ml) 1 个 (12ml)
产品简介
本试剂盒包含Ni-Agarose 填料、亲和柱空柱以及可溶性His 融合蛋白纯化所需的全部试剂（细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分），使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag 蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有 6 个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4 个 Ni2+ 螯合位点，较只有3 个螯合位点的Ni-IDA 结合 Ni2+ 更为牢固，有效防止纯化过程中 Ni2+ 脱落且增强对 His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。
支 持 物： CL-6B 琼脂糖凝胶
载量：20-30mgHis标签蛋白/ml 填料
粒径：50-160 μm
注意事项
1. 在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化，如需纯化包涵体蛋白，请选择我公司的包涵体蛋白纯化试剂盒，货号为K0893。
2. 缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT 和EDTA。
3. 整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
4. 为提高纯化效率，首先确定BindingBuffer 和 ElutionBuffer 中咪唑的*使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，BindingBuffer 的范围为 0-10mM，洗脱缓冲液的范围为10-500mM来进行。并通过SDS-PAGE或WesternBlotting 来检测目的蛋白的纯度。
5. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22µm 或者0.45µm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22µm 或者0.45µm 过滤器过滤。
6. 柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。
操作步骤
组装层析柱
1. 将填料混匀后加入层析柱，室温静置10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：（1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mgHis标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合 液加入层析柱。
（2）如果乙醇不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使乙醇流出。
（3）本实验都是通过重力作用使溶液流出。
2. 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用 10 倍柱体积的Binding Buffer 平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。
可溶性蛋白的纯化（BindingBuffer和ElutionBuffer配方详见附表1）
1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液（每1ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物），超声裂解菌体。
注意：（1） 当提取物粘度高或提取蛋白为包涵体时，建议加入DNaseI和Lysozyme。每1ml 细菌抽提试剂中加入1μlDNaseI（1,000U/ml），2μlLysozyme（50mg/ml），DNaseI和Lysozyme可单独从我公司购买，货号：Lysozyme(#YJ0887)、 DNaseI(#YJ2090A)，如使用其它公司产品，请按照相应说明书操作。
（2）超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件依赖于所使用的超声仪功率，探头种类，容器的大小形状，需实验中自己摸索，应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间，多次超声，通过一定的间隔时间避免溶液过热。终以菌液变清即可。
2. 10000rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
3. 用BindingBuffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
注意：（1）本试剂盒中附带有一块筛板，使用时先将筛板加至填料的上层，该筛板可用于杂质较多的蛋白的过滤，防止过多的杂蛋白堵塞柱子的作用。再将处理好的样品负载上柱，但是筛板放入柱子后就不易取出。
（2）通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
4. 使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
5. 使用适量Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
注意：洗脱峰可以分管收集，每1ml收集1管，并采用蛋白监测仪监测，收集洗脱峰。
6. 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。
注意：如果是分段梯度洗脱，大洗脱缓冲液中咪唑浓度未达到500mM时，则使用浓度为500mM的咪唑进行洗脱10倍柱体积后，再进行第6步的操作。
柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1. 使用2 倍柱体积的6M盐酸胍冲洗后，使用3 倍柱体积的去离子水冲洗。
2. 使用1 倍柱体积2% SDS冲洗。
3. 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5 倍柱体积100%乙醇冲洗，再依次使用 1 倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。
4. 使用1 倍柱体积的去离子水冲洗。
5. 使用5 倍柱体积含50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。
6. 使用3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积20%乙醇冲洗。
7. 4°C 保存。
8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积50 mM NiSO4再生，3 个柱体积的Binding Buffer平衡。
附表 1. 可溶性蛋白纯化缓冲液配方
成分 Tris-HCl（PH7.9） 咪唑 NaCl
SolubleBindingBuffer 20mM 10mM 0.5M
SolubleElutionBuffer 20mM 500mM 0.5M
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