尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）说明书

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存：-20℃

组分说明

Cat.No.              K0951      K0951A

KitSize               200U      5×200U

 Uracil-N-Glycosylase，1U/μl        200 μl    5×200 μl

产品简介

     尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也称为尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，该蛋白分子量为25kD，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，并且对RNA无活性，主要应用于防止PCR扩增产物的污染。该酶作用机理为：在PCR反应中以dUTP代替dTTP，扩增产物片段中的T全部被U取代，形成了含dU碱基的PCR扩增产物。UNG酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解反应体系中含U的DNA，有效消除PCR产物的残留污染，大大降低扩增产物污染导致的假阳性，从而保证扩增的特异性和准确性。

单位定义

     37℃，60分钟内催化1nmol尿嘧啶，从含尿嘧啶的DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。

质量控制

     SDS-PAGE检测纯度大于95%；经检测无核酸内、外切酶活性。

注意事项

1. UNG长期储存(非频繁使用; 每月少于3次)请置于-70℃保存，每天或每周使用请于-20℃保存。尽量避免反复冻融，大包装建议分装使用。

2.UNG可以在PCR反应前先清除不慎污染的U-DNA分子，一个实验室必须在所有的PCR反应中使用dUTP作为dNTP之 一，使所有扩增产物都成为U-DNA。如单使用于某个检测，T-DNA仍会积累，此抗污染系统也难以起到*的作用。

3. UNG/dUTP系统是PCR试剂内部的一种防污染措施，为了防止PCR产物的污染，尤其是在临检实验室中反复放大同一片段时，必须严格规范实验室的分划和操作。  

使用方法

以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据具体实验进行相应的改进和优化。

1.  PCR反应体系：

试剂                     50μl反应体系               终浓度

TaqPCRBuffer，10×                   5μl                1×

dATP，10mM                       1μl              200μM 

dGTP，10mM                       1μl              200μM

dCTP，10mM                        1μl              200μM

    

dTTP，10mM                      0.5 μl            100μM

    

dUTP，10mM                        1μl              200μM

    

ForwardPrimer，10μM                  1μl            0.2μM

ReversePrimer，10μM                  1μl             0.2μM

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            ，

TaqDNAPolymerase       5U/μl         0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase，1U/μl             0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

    注意：TaqDNAPolymerase与Uracil-N-Glycosylase的反应缓冲液和酶储存液可以通用。

2.  PCR 反应条件： 

     

步骤               温度             时间

    

UNG消化          37℃-50℃        5-10min

    

预变性               95℃           10min

    

变性               94℃            30s

退火             55-65℃           30s         30-40 个循环

延伸              72℃           1min

    

延伸

    注意：通常将Taq酶与UNG酶按一定的比例加入终PCR反应体系中，先于72℃37℃-50℃范围内消化 5min5-10分钟，然后95℃10分钟灭活，（同时这一步也达到预变性和热启动的效果），随后进行PCR扩增。UNG酶的反应可以在37℃-50℃，5-10分钟的范围内变化，可以根据实验的需要进行调整。

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