一步法快速WB（HRP）试剂盒（兔）说明书
One Step Western Kit HRP (Rabbit)
目录号：K2029
保存条件：2-8℃保存，避免冷冻。
组分说明
Cat. No. K2029 K2029A K2029B
Kit Size 10 2 50
封闭液 125 ml 3 0ml 500 ml
抗体反应液 HRP（兔）1 ml 2 0 0μl 5×1 ml
抗体稀释液 125 ml 3 0m l 500 ml
漂洗液（10×） 125 ml 3 0 m l 500 ml
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途产品简介
一步法快速WB试剂盒（兔）是上海研谨生物近期推出的Western Blot检测试剂盒，能够在1小时左右得到高质量的Western Blot结果，且操作简便、检测灵敏度高、背景低、不需再加入二抗、系统稳定性强。常规的Western Blot间接法检测过程（封闭、一抗结合和二抗结合）需要较长的时间，实验流程复杂且需要多步条件优化。胶上的蛋白转移到载体膜上后，使用试剂盒中的封闭液孵育5 min，再用抗体反应液处理后的一抗孵育载体膜，经洗涤三次（每次5 min）后，即可进行发光或显色检测。本试剂盒针对目的蛋白一抗为兔来源的实验系统使用。
注意事项
1. 客户需自己准备兔来源的一抗。
2. 使用封闭液、抗体稀释液（兔）、漂洗液之前请充分混匀。
3. 漂洗液如在2-8℃保存时出现沉淀，请恢复到室温，把沉淀溶解后正常使用，1×漂
洗液可在室温保存一个月。
4. 建议转膜完成后用丽春红等试剂染色，并把膜上多余部分剪去以增加试剂的使用效
率。
5. 一抗和抗体反应液HRP（兔）需要通过预实验来确定最*+佳的稀释用量。
6. 抗体反应液HRP（兔）、抗体稀释液和抗体用量可根据膜的大小按比例放大或减少。
7. 加入一抗的抗体稀释液可以回收重复使用一次。特异性及亲和力低的抗体不建议重
复使用。回收后抗体如在1-2天内使用放置在2-8℃，长期保存请在-20℃冻存，避
免多次反复冻融。
8. 如果存在较高背景的情况，请调整抗体的用量，并增加洗膜次数。
9. 试剂盒内所有试剂请于2-8℃保存，避免冻融。
操作步骤
本产品适用于转膜完成后的封闭及抗体孵育步骤，以5 cm×8 cm 膜为例：
1．漂洗液准备：取10 ml 10×漂洗液用蒸馏水稀释至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml。
2．转膜完成后，将膜浸没到10 ml封闭液中，室温封闭5分钟。
3．倒掉封闭液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于摇床上用较大速度漂洗1分钟。
4．洗膜的同时可准备抗体孵育液：取抗体反应液HRP（兔）100 μl到EP管中，加入兔
源一抗3-10 μg，枪头吸打至充分混匀，室温孵育5分钟。
5．将混匀的抗体与反应液HRP（兔）混合液加入到10 ml 抗体稀释液中，充分混匀。
注意：1）一抗的用量也可根据抗体的稀释度来进行调整。以抗体的最终稀释度1:1000为例，取100 µl抗体反应液HRP（兔）到EP管中，加入10 µl一抗，加入到10 ml 抗体稀释液中，充分混匀，室温孵育5分钟。
2）如果膜面积较小，可按比例减少抗体、反应液及稀释液的用量。
6．步骤3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，将混合一抗、反应液及稀释液的抗体孵育液
加到膜上（确保孵育液*浸没膜表面），在摇床上以60rpm左右的速度室温孵育40分钟。
7．弃去（回收）抗体稀释液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分钟。
8．进行后续检测。建议采用ECL试剂盒（K0049）进行检测。
常见问题解答
问 题：信号太弱或者看不到条带
可 能 原因：
a蛋白上样量太少
b蛋白转膜效率太低
c一抗亲和力较低
解决方案:
a进行SDS-PAGE电泳时加大上样量。
b优化转膜时间或者电流，确保转膜时膜与胶之间没有气泡。
c增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育时间。
增加抗体浓度可以增加信号。
d 对于低亲和力抗体来说，减少洗膜时间可以增加信号。
由每次10min，减少到每次5min可以增加信号。
问 题：背景偏高
可 能 原因：
a一抗使用过量
b一抗有非特异性结合或者与封闭试剂有交叉反应
c洗膜时间太短
d曝光显影时间过长
e容器或者试剂被污染
解决方案:
A减少一抗的使用量，相应的减少WB-1用量。
B使用pretreat A-b（M01052）。 客户还可以使用Quick Block Optimization kit 来找到最*+佳的封闭试剂。
C增加洗涤的步骤可以进一步的降低背景。
D减少曝光时间。如果信号和背景都高，可以等待一段时间，等背景信号减弱后，再进行曝 光。
e每次洗涤的时候使用清洁的容器。带手套，使用清洁的镊子处理膜。
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