阿维菌素（IVM）ELISA检测试剂盒

使用说明书

一、检测原理

本试剂盒利用阿维菌素抗体与阿维菌素可产生特异性结合的性质，先在酶标板上预包被抗原，再加入标准品（样本）和阿维菌素抗体，样本或标准品中的阿维菌素药物与固定在酶标板上的抗原竞争阿维菌素抗体，后加入底物催化显色。此时显色深度与标准品（样本）中阿维菌素药物的含量成反比。

二、检测范围

本试剂盒是应用ELISA技术研发的药物残留检测产品，与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测组织以及液态奶样本中的阿维菌素。

三、交叉反应率

阿维菌素类……………………………………………100%

伊维菌素………………………………………………25%

埃普菌素………………………………………………10%

多拉菌素………………………………………………6%

四、试剂盒组成

酶标板1块，96孔/板

标准液6瓶（1 mL/瓶）：

0ppb,0.5ppb,1.5 ppb，4.5ppb,13.5ppb,40.5ppb

酶标记物稀释液 ………………………………………7mL

11×酶标记物浓缩液………………………………0.7mL

底物液A ………………………………………………7mL

底物液B………………………………………………7mL

终止液…………………………………………………7mL

20×浓缩洗涤液……………………………………30mL

复溶工作液………………………………50mL

组织样本处理液……………………………10mL

说明书……………………………………1份

五、使用单位需自备的设备及试剂

（1）仪器

微孔板酶标仪(450 nm/630 nm)

振荡器

离心机

涡旋仪

粉碎机

电子天平（感量0.01 g）

（2）器材

单道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）试剂

甲醇、去离子水

六、溶液的配制

样本前处理需配制：

配液1：洗涤工作液

用去离子水将浓缩洗涤液（20×）按1 : 19体积比进行稀释，即1份浓缩洗涤液加19份去离子水。

七、样本前处理方法

样本处理前须知：

处理任何样本时，都须注意：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理步骤：

组织：

1、 准确称取2±0.05g均质后的组织样品于10 mL离心管中；

2、 依次加入2mL甲醇，100μL组织样本处理液，充分涡动5 min使样本分散；

3、 室温下（25±2℃），4000 g离心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL复溶工作液中，涡动10s混匀；

5、 取50 μL用于分析。

原奶：

1、 取1mL液态奶于10 mL离心管中；

2、 加入3mL甲醇，充分涡动1 min；

3、 室温下（25±2℃），4000 g离心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL复溶工作液中，涡动10s混匀；

5、 取50 μL用于分析。

八、酶联免疫检测步骤

测定前须知：

1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。

2、使用之后立即将所有试剂放回2~8 ℃。

3、在使用中不要让微孔干燥。 

4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

测定步骤：

1、将所需试剂和微孔板从冷藏环境中取出，在室温下平衡30 min，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。

2、酶标记物工作液：取1份11×酶标记物浓缩液加10份酶标记物稀释液按照1:10的比例稀释即得。

3、加标准品：加标准品/样本50 mL/孔到对应的微孔中，加入酶标记物50 mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光反应30 min。

4、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 300μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5次，用吸水纸拍干。

5、显色：加入底物液A液50 mL/孔，再加底物液B液50 mL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15 min。

6、测定：每孔各加50 μL终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值（建议用450/630 nm双波长检测，在5 min内读完数据）。

九、结果分析

所测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以DI一个标准液（0标准液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝

以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含阿维菌素的量。

利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

九、样本稀释倍数

组织： 6倍

液态奶： 10倍

十、试剂盒灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度：0.5ppb

样本低检测限：

组织……………………………………4 ppb

液体奶…………………………………5 ppb

回收率：90%±30%

精密度：试剂盒的变异系数均小于10%

十一、注意事项

1、室温低于20 ℃或试剂及样本没有回到室温（20~25 ℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤；若不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。

4、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

5、保存试剂盒于2~8 ℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

6、显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之；0标准的吸光度（450 nm）值小于0.5（A_450nm< 0.5）时，表示试剂可能变质。

7、在加入底物液后，一般显色15 min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20 min（或更长），但不得超过30 min；反之，则减短反应时间。

8、该试剂盒zui佳反应温度为25 ℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

十二、贮藏条件及保存期

贮藏条件：在2~8 ℃保存试剂盒。

保存期：本试剂盒有效期为12个月。