考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定，

确保蛋白浓度在0~1000µg/ml范围内。

测定意义

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在595nm处有大吸收峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品

离心机、可见分光光度计、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

标准品：液体×1 瓶，4℃保存。

样品中可溶性蛋白质提取

1. 液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约 0.1g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1. 分光光度计预热30min，蒸馏水调零。

2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，

于595nm比色，10~20min 完成比色，记为A空白管。

3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL标准液，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，

于595nm比色，10~20min 完成比色，记为A标准管。

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入200μL待测液，1000μL试剂一，混匀后室温静置10min，

于595nm比色，10~20min完成比色，记为A测定管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。

计算公式:

Cpr（µg/mL）= C标准管×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)

=50×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)

C 标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。

注意事项：

1.加考马斯亮蓝后，在10~20min 内吸光值相对较稳定，因此须在10~20min 完成比色。

2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用 95%乙醇冲洗。

3.测定前用1~2个样做预实验，确保蛋白浓度在0~1000µg/ml 范围内，否则需要做相应稀释，使得稀释后的结果在 0~1000µg/ml 范围内，然后再乘以稀释倍数。

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