辅酶ⅠNAD(H)含量测定试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶 NAD(H)Ⅰ广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD⁺。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD⁺比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD⁺比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD⁺降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570nm下检测吸光值；而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；

试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NAD⁺和NADH的提取

1  血清（浆）中 NAD⁺和NADH的提取

NAD⁺的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；

冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建

议取约0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2  组织中 NAD⁺和NADH 的提取：

NAD⁺的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1g组织，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3  细胞或细菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液），超声波破碎 1min（冰浴，强度20％或200W，超声2s，停1s），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：碱性提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液），超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声2s，停1s），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：

混匀，取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下读取对照吸光值A1和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAD⁺或 NADH.

NAD⁺和NADH含量的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（一）NAD⁺含量的计算

1、血清（浆）中 NAD⁺含量计算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[(△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099）

2、组织、细菌或细胞中 NAD⁺含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺(nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)

=36.1×(△A-0.099）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD⁺(nmol/g 鲜重）= [(△A-0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 72.2×(△A -0.099）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD⁺(nmol/10⁴cell）=[(△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099）

（二）NADH 含量的计算

1、血清（浆）中NADH含量计算

NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065）

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 49.4×(△A -0.065）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/10⁴cell）= [(△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.0988×(△A -0.065）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（一）NAD⁺含量的计算

1、血清（浆）中 NAD⁺含量计算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×72.2×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 1444×(△A -0.099）

2、组织、细菌或细胞中 NAD⁺含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(V1×Cpr)

= 72.2×(△A -0.099）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NAD⁺ (nmol/g 鲜重）= [(△A-0.099）×72.2×V1)]÷(W×V1÷V2)

= 144.4×(△A -0.099）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD⁺(nmol/10⁴cell）=[(△A -0.099）×72.2×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.2888×(△A -0.099）

（二）NADH 含量的计算

1、血清（浆）中 NADH 含量计算

NADH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 988×(△A -0.065）

2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(V1×Cpr)

= 49.4×(△A -0.065）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.065）×49.4×V1) ]÷(W×V1÷V2)

= 98.8×(△A -0.065）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADH (nmol/10⁴cell）= [(△A-0.065）×49.4×V1) ]÷(500×V1÷V2)

=0.1976×(△A -0.065）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注意：低检测限为 1nmol/mL 或 或 1nmol/g  鲜重 或 或 0.01nmol/mg prot

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