谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)

试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：正是测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体×1 支，-20℃保存。

混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一40 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三，混匀。（注意：必须现配现用，当天使用完）

试剂四：液体×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS 的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

GSH-Px 催化H₂O₂氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH 还原GSSG，再生GSH，同时NADPH 氧化生成NADP⁺；NADPH 在340 nm有特征吸收峰，而NADP⁺没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）:试剂一体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取0.1g 组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量10⁴个：试剂一体积（ml）500~1000:1 的比例,建议500 万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3 s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

二、测定操作:

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 混合试剂在25℃或者37℃（哺乳动物）水浴中预热30min 以上。

3. 空白管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL 蒸馏水、800μL 预热的混合试剂，100μL试剂四，迅速混匀后于340nm处测定第10 s和第190s的吸光值，分别记为A空1和A空2，△A 空白管= A空1﹣A空2。

4. 测定管：依次在1mL 石英比色皿中加入100μL 上清液、800μL 预热的混合试剂，100μL试剂四，迅速混匀后于340nm 处测定第10 s和第190s 的吸光值，分别记为 A测1 和A测2，△A 测定管= A测1﹣A测2。

注意：空白管只需测定一次。

三、GSH-Px 活性计算：

(1). 按蛋白浓度计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每 mg 蛋白每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。

GSH-Px (U/mg prot)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（ Cpr×V 样）÷T

=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每g 样本每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。

GSH-Px (U/g)=[(△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（W×V 样÷V样总）÷T

=536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

(3). 按细胞数量计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每10⁴个细胞每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。

GSH-Px (U/10⁴ cell)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁹]÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

=536×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

(4). 按液体体积计算

GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化1nmol NADPH 氧化为1个酶活单位。

GSH-Px (U/ml)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷V 样÷T

=536×(△A测定管-△A空白管)

ε:NADPH 摩尔消光系数6.22×10³L/mol/cm；V 反总：反应体系总体积，1000μL=0.001 L；

10⁶：1mol=1×10⁶μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V 样：加入反应体系中上清液体，100μL =0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min。

注意事项：

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力。

2. 混合试剂和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完。

3. 测定过程操作须迅速。

4. 细胞中GSH-Px 活性测定时，细胞数目须在300 万-500 万之间，细胞中GSH-Px 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。

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