单胺氧化酶(MAO)试剂盒说明书微量法 |
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单胺氧化酶(Monoamine Oxidase,MAO)试剂盒说明书 微量法 注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义: MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎动物的各种器官,特别是分泌腺、脑、肝脏,在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢,含量较低,具有重要的生理功能,其活 性能反映肝纤维化的程度。此外,MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转出现紊乱,从而引发多种病症。 测定原理: MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛,进一步氧化成酸;底物在360nm处有特征吸收峰,测定360nm光吸收下降的速率,计算MAO活性。 自备实验用品及仪器: 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。 试剂组成和配制: 提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。 提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。 试剂一:液体 60mL×2 瓶,4℃保存。 试剂二:液体 2mL×1 管,4℃避光保存。 粗酶液提取: 1. 称取约0.1g样品,加1mL预冷的提取液一充分冰浴匀浆,1000g,4℃,离心10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心30min,弃上清;加入1mL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷的1mL试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定)。 2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心30min,弃上清;加入1.0mL预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心40min,弃上清;沉淀加入预冷的1.0 mL试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定),取上清置于冰上待测。 3. 血清:直接测定。 测定操作表: 1、分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至360nm。 2、操作表
注意:空白管只需测定一次。 MAO 活性计算公式: a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、按蛋白含量计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每毫克蛋白质1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V反总÷(V样× Cpr)÷T= 114×ΔA÷Cpr 2、按样本质量计算: 酶活定义:37℃,pH7.6时,每克样品1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/g)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T = 114×ΔA÷ W 3、按照细胞数量计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每104个细胞1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/104cell)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T = 114×ΔA÷细胞数量 4、按照液体体积计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每升血清1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/L)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷V 样=114×ΔA ε :底物摩尔消光系数,1460L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.2mL; V 样:反应中样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、按蛋白含量计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每毫克蛋白质1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/mg prot)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T= 228×ΔA÷Cpr 2、按样本质量计算: 酶活定义:37℃,pH7.6时,每克样品1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/g)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T = 228×ΔA÷ W 3、按照细胞数量计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每104个细胞1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/104cell)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T = 228×ΔA÷细胞数量 4、 按照液体体积计算 酶活定义:37℃,pH7.6时,每升血清1min内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。 DAO 活性(nmol/min/L)=ΔA÷ε÷d×V 反总÷V 样=228000×ΔA ε :底物摩尔消光系数,1460L/mol/cm; d:96孔板光径,0.5cm;V 反总:反应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g 注意事项: 1、吸光度变化应该控制在 0.01~0.8 之间。否则加大样品量或稀释样品,注意计算公式中参 与计算的稀释倍数要相应改变。 2、样品蛋白质含量需要另外测定。 江南娱乐 jn平台 服务:
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